四川大学华西口腔医学院种植科满毅教授团队长期致力于软/硬组织再生形态构建、静电纺丝技术、软/硬组织再生调控机制和定向分化的研究，近期于Bioactive Materials发表研究成果”TheDiameter Factor of Aligned Membranes Facilitates Wound Healing by Promoting Epithelializationin an Immune Way”，论文共同第一作者为王陈兵博士、朱宸佑博士等。
近年来随着免疫学进展，逐步发现材料介导组织再生过程涉及不同免疫细胞的参与，其中包括T细胞、B细胞等，如何调动促进修复相关细胞的聚集以及行使功能，从而促进组织再生成为解决临床软组织缺损的良好策略之一。项目组前期通过静电纺丝技术构建了无序形貌、取向形貌、网格形貌三种引导组织再生膜，体内外实验提示网格形貌材料能够有效恢复骨缺损，取向型材料能够软组织缺损愈合。单细胞测序结果提示取向组能够募集效应T 细胞数量，提示材料对于局部免疫进程向适应性免疫推进。在免疫微环境对软组织修复的调控作用上，皮肤组织的主要构成细胞（角质细胞和成纤维细胞）通过多种信号通路和免疫细胞相互作用，局部组织愈合是免疫细胞和组织细胞共同作用、相互影响的结果。前期成果发表于Science Advances期刊,并被Science正刊报道（图1）（详细解读：华西口腔种植科满毅最新《Science》子刊：材料界也看“颜值”，组织修复也“看脸”——生物材料表面形貌对免疫微环境的调控机制）。
图1 前期研究成果获Science正刊报道
在此基础上，课题组进一步发现生物材料的形貌特征——直径，在伤口愈合过程调控相关免疫反应方面发挥着重要作用（图2）。课题组制备了不同直径的取向形貌静电纺丝膜。与其他膜相比，纤维直径为300nm的A300组静电纺丝膜显著促进细胞增殖和扩散，促进伤口愈合（上皮化和血管化），并诱导未成熟毛囊的再生。转录组学揭示了A300促进免疫相关过程及向促组织愈合方向发展的分子机制，提示其显著促进角化细胞迁移和皮肤创面愈合。所有结果表明，伤口愈合需要免疫过程的积极参与，A300材料是引导皮肤再生应用的潜在候选对象。
图2静电纺丝技术制备不同纤维直径系列取向材料，利用转录组测序探究材料诱导全层皮肤缺损愈合的免疫调控机制
首先，通过调节电极与收集器的距离、注入速率和溶液浓度，制备了不同直径的取向型静电纺丝膜，直径分别为319±100 nm（A300）、588±132nm（A600）和1048±130 nm （A1000）（图3）。其中A300组显著提高了取向膜材料的机械稳定性、亲水性和降解性能，为防止皮肤创面瘢痕形成、促进微血管生成提供了良好的条件，且不具有生物毒性，在21天时完全降解。
图3.（A）材料理化性能评估流程图；（B）电镜下不同纤维直径膜表面形貌
CCK-8实验提示A300材料能够促进成纤维细胞（L929）增殖，加速角质形成细胞（HOK）在取向形貌膜材料上的迁移（图4）。提示细胞在膜上活性与纤维直径和拓扑结构密切相关，其直接影响细胞对营养物质的粘附和交换过程。
图4.（A）体外实验流程图；（B）L929和（C）HOK的CCK-8试验;(D)相应分析
在大鼠的全层皮肤缺损模型中再次证实了A300材料组的促皮肤愈合效应（图5）。植入A300材料组别在各时间点的剩余伤口面积、上皮间隙均明显小于其他各组；再上皮化、血管化效应均明显优于其他组，能够提前1~2天完成再上皮化过程；术后14天时，HE切片也提示A300组具有更多的毛囊再生。皮下植入模型提示A300材料周围的纤维囊厚度（28.40±2.38μm）明显薄于A600（43.68±6.47μm）和A1000（71.66±7.83 μm）组，且材料周围募集的免疫细胞数量明显少于其他组，证实A300材料具有良好的生物相容性，植入体内后能够避免不良异物反应，是诱导全层皮肤愈合的潜在候选材料之一。
图5.（A）评估大鼠皮肤创面愈合的实验流程;（B）大鼠皮肤缺损的表面图像及；（C）相应分析;（D）大鼠皮肤缺损H&E图像及（E）对应分析;
为了进一步探究A300材料调控炎症/异物反应进程进而促进皮肤创面愈合的具体机制，取术后7天皮肤缺损样本进行bulkRNA测序（图6）。PCA结果提示A300材料主成分与其他组别不同，GO功能富集分析提示A300材料显著上调了正向免疫调控、固有免疫相关条目，基因表达热图说明A300材料可能通过积极调节免疫反应来降低炎症/异物反应，从而达到更好的创面愈合效果。其中显著差异表达的基质金属蛋白酶12(matrix metalloproteinases 12, MMP12) 基因在免疫调控相关GO条目均有富集，qRT-PCR、ELISA实验均证实A300组MMP12的高表达。Trans-well实验也证实适宜浓度的MMP12因子能够促进HOK细胞的迁移。
图6.（A）MMP12在大鼠皮肤缺损中的作用研究流程;（B）第7天BulkRNA测序的PCA图像;（C）A300VSCtr;（D）A300VSA600和（E）A300VSA1000的BulkRNA测序GO分析结果；(F)免疫应答正调控相关基因热图;(G)固有免疫反应基因相关热图;
KEGG富集结果显示，相对于对照组和A1000组，A300显著上调了与巨噬细胞亚型转换相关的溶酶体和吞噬体相关信号通路（图7），基因表达热图证实了A300材料显著上调了修复型巨噬细胞亚型的相关通路。同时A300材料显著上调了Cd68、IL-10和TGF-β的RNA表达，证实了A300组取向膜确实促进了免疫相关过程向促愈合方向发展。
图7.（A）巨噬细胞亚型转化研究流程;（B）巨噬细胞分泌的MMP12; （C）A300VSCtr， （D）A300VSA600和（E）A300VSA1000大鼠样本术后第7天bulk RNA测序KEGG功能富集结果; （F）溶酶体热图; （G）吞噬热图; （H）修复性巨噬细胞的热图;（I）Cd68、IL10、TGFβ的RNA表达;
进一步探究材料对巨噬细胞生物活性的影响，细胞学实验提示A300组材料上巨噬细胞的粘附和延伸情况优于其他组(图8)，说明A300对巨噬细胞的行为有调控作用。细胞划痕实验提示A300组材料巨噬细胞条件培养基促进角质形成细胞的迁移。此外，MMP12和巨噬细胞修复标志物在A300组的表达更显著。更重要的是，MMP12可增强A300巨噬细胞条件培养基的促进迁移作用，而MMP12抑制剂可在很大程度上抑制这一作用，证明A300膜上巨噬细胞分泌的MMP12促进角质形成细胞迁移。
图8 （A）巨噬细胞和MMP12体外功能验证流程; （B）巨噬细胞在不同直径静电纺丝膜上的CLSM图像及（C）相应分析; （D）接种在不同膜上的巨噬细胞产生的条件培养基刺激HOK的迁移，及（E）相应的分析; （F）MMP12的RNA表达;（G）MMP12酶联免疫吸附试验结果;（H）巨噬细胞的流式结果; （I）trans-well实验及（J）相应分析。
综上所述，皮肤伤口愈合需要免疫系统的积极参与，生物材料的纤维直径能够改变免疫系统进程，而A300是取向形貌膜材料的一个较优的设计，是引导皮肤再生应用的潜在生物工程材料之一。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X21004400
原文链接：
https://advances.sciencemag.org/content/7/22/eabf0787
https://science.sciencemag.org/content/372/6545/twis
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